七、蛋白质的分离和纯化

1、沉淀，见六、2

2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。

3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。

4、层析：

a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。

b.分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。

5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。

第二章　　核酸的结构与功能

一、核酸的分子组成：基本组成单位是核苷酸，而核苷酸则由碱基、戊糖和磷酸三种成分连接而成。

两类核酸：脱氧核糖核酸(DNA)，存在于细胞核和线粒体内。

核糖核酸(RNA)，存在于细胞质和细胞核内。

1、戊糖：DNA分子的核苷酸的　糖是β-D-2-脱氧核糖，RNA中为β-D-核糖。

2、磷酸：生物体内多数核苷酸的磷酸基团位于核糖的第五位碳原子上。

二、核酸的一级结构

核苷酸在多肽链上的排列顺序为核酸的一级结构，核苷酸之间通过3′，5′磷酸二酯键连接。

三、DNA的空间结构与功能

1、DNA的二级结构

DNA双螺旋结构是核酸的二级结构。双螺旋的骨架由　糖和磷酸基构成，两股链之间的碱基互补配对，是遗传信息传递者，DNA半保留复制的基础，结构要点：

a.DNA是一反向平行的互补双链结构　亲水的脱氧核糖基和磷酸基骨架位于双链的外侧，而碱基位于内侧，碱基之间以氢键相结合，其中，腺嘌呤始终与胸腺嘧啶配对，形成两个氢键，鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对，形成三个氢键。

b.DNA是右手螺旋结构　螺旋直径为2nm。每旋转一周包含了10个碱基，每个碱基的旋转角度为36度。螺距为3.4nm，每个碱基平面之间的距离为0.34nm。

c.DNA双螺旋结构稳定的维系　横向靠互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持，尤以后者为重要。

2、DNA的三级结构

三级结构是在双螺旋基础上进一步扭曲形成超螺旋，使体积压缩。在真核生物细胞核内，DNA三级结构与一组组蛋白共同组成核小体。在核小体的基础上，DNA链经反复折叠形成染色体。

3、功能

DNA的基本功能就是作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板，它是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础。

DNA中的核糖和磷酸构成的分子骨架是没有差别的，不同区段的DNA分子只是碱基的排列顺序不同。

四、RNA的空间结构与功能

DNA是遗传信息的载体，而遗传作用是由蛋白质功能来体现的，在两者之间RNA起着中介作用。其种类繁多，分子较小，一般以单链存在，可有局部二级结构，各类RNA在遗传信息表达为氨基酸序列过程中发挥不同作用。如：

名　　称功　　能

核蛋白体RNA　(rRNA)核蛋白体组成成分

信使RNA　(mRNA)蛋白质合成模板

转运RNA　(tRNA)转运氨基酸

不均一核RNA　(HnRNA)成熟mRNA的前体

小核RNA　(SnRNA)参与HnRNA的剪接、转运

小核仁RNA　(SnoRNA)rRNA的加工和修饰

1、信使RNA(半衰期最短)

1)hnRNA为mRNA的初级产物，经过剪接切除内含子，拼接外显子，成为成熟的mRNA并移位到细胞质

2)大多数的真核mRNA在转录后5′末端加上一个7-甲基鸟嘌呤及三磷酸鸟苷帽子，帽子结构在mRNA作为模板翻译成蛋白质的过程中具有促进核蛋白体与mRNA的结合，加速翻译起始速度的作用，同时可以增强mRNA的稳定性。3′末端多了一个多聚腺苷酸尾巴，可能与mRNA从核内向胞质的转位及mRNA的稳定性有关。

3)功能是把核内DNA的碱基顺序，按照碱基互补的原则，抄录并转送至胞质，以决定蛋白质合成的氨基酸排列顺序。mRNA分子上每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸，为三联体密码。

2、转运RNA(分子量最小)

1)tRNA分子中含有10%～20%稀有碱基，包括双氢尿嘧啶，假尿嘧啶和甲基化的嘌呤等。

2)二级结构为三叶草形，位于左右两侧的环状结构分别称为DHU环和Tψ环，位于下方的环叫作反密码环。反密码环中间的3个碱基为反密码子，与mRNA上相应的三联体密码子形成碱基互补。所有tRNA3′末端均有相同的CCA-OH结构。

3)三级结构为倒L型。

4)功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的戴本并将其转呈给mRNA。

3、核蛋白体RNA(含量最多)

1)原核生物的rRNA的小亚基为16S，大亚基为5S、23S;真核生物的rRNA的小亚基为18S，大亚基为5S、5.8S、28S。真核生物的18SrRNA的二级结构呈花状。

2)rRNA与核糖体蛋白共同构成核糖体，它是蛋白质合成机器--核蛋白体的组成成分，参与蛋白质的合成。

4、核酶：某些RNA 分子本身具有自我催化能，可以完成rRNA的剪接。这种具有催化作用的RNA称为核酶。

五、核酸的理化性质

1、DNA的变性

在某些理化因素作用下，如加热，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为变性。监测是否发生变性的一个最常用的指标是DNA在紫外区260nm波长处的吸光值变化。解链过程中，吸光值增加，并与解链程度有一定的比例关系，称为DNA的增色效应。紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度(Tm)，一种DNA分子的Tm值大小与其所含碱基中的G+C比例相关，G+C比例越高，Tm值越高。

2、DNA的复性和杂交

变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性，其过程为退火，产生减色效应。不同来源的核酸变性后，合并一起复性，只要这些核苷酸序列可以形成碱基互补配对，就会形成杂化双链，这一过程为杂交。杂交可发生于DNA-DNA之间，RNA-RNA之间以及RNA-DNA之间。

六、核酸酶(注意与核酶区别)

指所有可以水解核酸的酶，在细胞内催化核酸的降解。可分为DNA酶和RNA酶;外切酶和内切酶;其中一部分具有严格的序列依赖性，称为限制性内切酶。